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浅谈生物制药中的CHO细胞培养工艺开发

2020-05-06 08:20:24

未来随着制药企业在生物制剂领域的投入,预计至2021 年全球生物药市场都将按照复合年增值率19% 的速度增长,以市场微末计算,2021年将达到200 亿美元。中国生物药市场由于基数小,增长空间将会更大,增速也会更加强劲,预计2021 年中国生物制剂市场规模将达到92亿人民币,随着国内生物类似药陆续上市,将有望呈现爆发式增长。

CHO细胞因其能够快速、高水平的表达多种重组蛋白,使用悬浮培养工艺易于放大培养,在生物制药领域中被广泛应用于生产治疗型蛋白。

在细胞培养工艺开发时,所用物料在满足细胞的营养需求外,要完全符合c GMP的规定,选择无动物源成分的化学成分限定的培养基,且满足基因型扩增和相应筛选系统的培养条件。通常所用培养基可以分为传代培养基、生产培养基及补料培养基。传代培养基营养成分相较于生产培养基营养成分较为丰富,有利于细胞活性的恢复。补料培养基通常为氨基酸的复合物,且根据氨基酸的等电点差异分别流加,避免析出。在培养基之外还需准备相应的碳源补充料,一般为葡萄糖。此外在选择物料时还要综合考虑大规模培养的普适性和操作性。

小试阶段,在摇床的选择上要考虑到细胞对O TR、蒸发量的需求,通常在转移细胞培养工艺时会遇到双方摇床不一致的问题,导致O TR出现偏差,可以根据摇床的轨道半径做一个简单向心力的换算,再通过实验进行验证。

F:向心力 -N; m:质量 -g; n:转速 -rpm; r:轨道半径 -mm

在细胞生产放大过程中通常会根据规模的不同决定种子罐的级数及规模。以2 00 L中试规模为例,通常会用到一级50L的种子罐,此时需要考虑放大过程中的工艺参数设定,可以分别通过K La 、P/V、tip speed、科莫微尺度及C O2逃逸速度建模及混匀时间综合考虑,分别设定种子罐及生产罐的转速、底部通气类型及流量、表面通气流量,以及在培养过程中氧气、空气、二氧化碳的调控。通常K La 在5~12 h-1即可实现较高密度的细胞培养;K La 通常是在P/V基础上进行调整确定;哺乳动物细胞培养时t ip speed通常控制在2 m/s以下,降低细胞受到剪切力的伤害;科莫微尺度应大于细胞直径的5 0倍,从而减小剪切力对细胞的伤害。

基于以上原则进行的一次放大试验如下:

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细胞复苏与摇瓶扩增

1.1 将传代培养基(CD CHO)置于室温,使其温度恢复至室温后再转入37.0℃ 摇床内预热30 min;

1.2 利用移液器将种子细胞液从冻存管内吸出打入装有预热培养基的摇瓶内,摇床参数设置如下:



1.3 复苏后细胞密度为0 .31*10e6 cells/mL,活率为92.4%;

1.4 N-2~N-1由WAVE反应器进行扩种,所用反应袋规格分别为2 0 L、5 0 L。扩增阶段实验结果如下:



N-5~N-3阶段的稀释比为14,活率由97.2%提高到99.5% ,细胞生长较为稳定,比生长速率为0.86~0.88 day-1。

N-2~N-1阶段采用ReadyToProcess WAVE 25反应器后,活率稳定在9 9% 以上,比生长速率分别为0.88 day-1、0.87 day-1,与摇瓶相比稳定性良好,未发生由于反应器、容器的更换而导致比生长速率发生变化。ReadyToProcess WAVE 25 参数设定如下:



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XDR-200一次性生物反应器生产

2.1生产前分别对pH (4.01和7.00)、DO(0和100%)、温度电极进行两点校正;

2.2将生产培养基ActiPro 打入XDR 200 L反应袋内预热到37℃ 后进行接种,接种后活细胞密度为0.45*10e6 cells/mL;

2.3 每天检测葡萄糖及乳酸浓度,当葡萄糖与乳酸浓度之和小于4 g/L 时,流加葡萄糖溶液到培养液中葡萄糖浓度为4 g/L;

2.4 分别在第3 天、第5天、第7天、第9天流加3%的补料培养基cell boost 7a和0.3%的cell boost 7b,向培养液中补充氨基酸。

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实验结果

细胞密度变化如图1 。在200L的实验中,在第五天细胞密度为17*10e6 cells/mL时,调节温度到3 1.0℃,比生长速率变低,在第 7天达到最 高值24.87*10e6 cells/mL,此后稳定在22*10e6 cells/mL~24*10e6 cells/mL之间。



图1 细胞密度变化



图2 细胞活率变化

葡萄糖及乳酸浓度变化如图3 、4,葡萄糖在细胞指数生长期被快速利用,从而产生大量的乳酸,在第4天达到峰值2.03 g/L 。此后由于补糖策略的优化,乳酸浓度逐渐下降,但在收获当天仍含有0.38 g/L,培养工艺需进一步优化。细胞活率由于乳酸的影响,在第4天以后逐渐降低,截至收获当天活率为95.4 %。



图3 葡萄糖浓度变化



图4 乳酸浓度变化

第12 天降温到20℃后进行细胞液收获时,细胞密度为2 3.59*10e6 cells/mL,IgG产量达4.3 g/L ,与15 L实验结果较为一致。XDR 生物反应器设置参数如下:



生物反应器在中国大规模应用上仍处于起步阶段,随着现代生物技术发展,利用生物反应器进行生物制品生产是行业发展的必然趋势。利用生物反应器悬浮培养细胞生产抗原、抗体等是生物制品的核心技术,结合筛选驯化的高表达细胞株和精细化的放大工艺控制,从而能够有效提高生产效率、产品质量和降低成本,提高产品竞争力。


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